Методы диагностики гельминтозов. Метод толстого мазка под целлофаном

Ершова И.Б. , Осычнюк Л.М. , Мочалова А.А. , ГУ «Луганский государственный медицинский университет», кафедра педиатрии с детскими инфекциями.
Статья опубликована в журнале «Актуальная инфектология», №2 (3), 2014 год.
Информационный ресурс «Издательский дом Заславский» www.mif-ua.com

В статье изложены методы диагностики гельминтных инвазий: микроскопические, иммуноферментный анализ, серологические, полимеразной цепной реакции, биорезонансная диагностика, гемосканирование, а также инструментальные (ультразвуковое и рентгенологическое исследование, компьютерная томография) и лабораторные, имеющие косвенное значение (клинический анализ крови, анализ крови на печеночные пробы, анализ кала на дисбактериоз). Описаны достоинства методов, их недостатки, достоверность полученных данных. Предложены анкеты-опросники для пациентов для выявления риска инфицирования гельминтами. Описаны достоинства методов, их недостатки, достоверность полученных данных. Предложены анкеты-опросники для пациентов для выявления риска инфицирования гельминтами.

Гельминты оказывают отрицательное воздействие на организм человека. Они приводят к аллергизации, развитию полигиповитаминоза, макро- и микроэлементозов, нарушению кроветворения и проницаемости сосудов, гормональному дисбалансу. Гельминтозы способствуют формированию хронических заболеваний (холецистит, желчнокаменная болезнь, панкреатит, колит, сахарный диабет, бронхиальная астма, атопический дерматит), психоэмоциональных нарушений (хроническая усталость, раздражительность, тревожность, гиперактивность у детей), анемии и др. При длительной гельминтной инвазии может развиваться вторичный иммунодефицит .

Настороженность врачей в отношении гельминтозов у населения в настоящее время недостаточная, а профилактика сводится к лечению выявленных инвазированных пациентов.

Диагностика гельминтозов основывается на клинико-эпидемических и лабораторных данных. Такие признаки, как астенический синдром, рецидивирующая крапивница, нарушение регенерации кожи и слизистых оболочек, трудно поддающиеся лечению атопический дерматит и бронхообструктивный синдром, полилимфаденопатия и гепатоспленомегалия неясного генеза, аденоидные вегетации II–III степени, «географический» язык, сниженный или избирательный аппетит, неустойчивый стул, могут говорить о наличии гельминтов .

При серологическом исследовании определяют наличие антител к гельминтам (достоверность - около 60 %): при подозрении на эхинококкоз, цистицеркоз, трихинеллез, токсокароз широко используют реакции непрямой гемагглютинации, агглютинации латекса, связывания комплемента, иммунофлюоресценции .
Не во всех случаях методы определения специфических антител обладают достаточной специфичностью и достоверностью. Антигенный состав гельминта зависит не только от вида, но и от стадии; проходя сложный цикл развития от яйца до взрослой особи, гельминты меняют антигенный состав. Кроме того, в иммунодиагностических реакциях используются соматические антитела, а в организме хозяина антитела вырабатываются в основном на экскреты и секреты гельминта. Неспецифическая сенсибилизация организма, общность некоторых антигенов трематод, простейших и человека создают высокий удельный вес ложноположительных реакций в титрах ниже достоверно диагностических .

Метод определения гельминтов с помощью полимеразной цепной реакции является высокоспецифичным и высокочувствительным, но из-за дороговизны и сложности не может быть скрининговым, когда, например, нужно обследовать группу детей из детского учреждения .

Иммунная система не всегда реагирует (распознает и уничтожает) на наличие гельминтов в организме. Это объясняется тем, что некоторые гельминты имеют прочную и химически устойчивую капсулу или покрыты веществом, которое не распознается иммунной системой; локализуются в тканях, наиболее защищенных от воспалительных реакций, например в спинном мозге; многие виды из них в пищеварительном тракте выделяют антиэнзимы, что спасает их от гибели; имеют большую продолжительность жизни (годами, а иногда до смерти самого человека); питаются за счет гликолиза чистых углеводов; имеют такие приспособления, как присоски, крючки и др., что способствует фиксации внутри организма; у многих видов существует половое размножение, при котором происходит обмен генной информацией, что приводит к усилению гетерогенной популяции, уменьшению уязвимости; обладают высоким уровнем плодовитости.

При ультразвуковом , рентгенологическом исследовании органов брюшной полости , компьютерной томографии можно выявить косвенные признаки гельминтозов: гепатоспленомегалию, неравномерность паренхимы печени и селезенки за счет мелких гиперэхогенных сигналов, увеличенные лимфатические узлы в воротах селезенки и сами гельминты (эхинококки, клубки кишечных гельминтов и т.д.).

Гемосканирование - качественное исследование крови с помощью мощного темнопольного микроскопа, можно увидеть состояние клеток крови (форму, размер, активность, цвет и т.д.), наличие неспецифических элементов и веществ - все это напрямую или опосредованно говорит о наличии в организме гельминтов. Изображение выводится на экран монитора с помощью встроенной видеокамеры в микроскопе. Этот метод диагностики обладает высокой достоверностью .

Косвенными лабораторными признаками гельминтозов могут быть анемия, базофилия, эозинофилия, увеличение уровня аспартатаминотрансферазы. Так, при токсокарозе выявляется лейкемоидная реакция эозинофилов (более 20 %) на фоне стойкого аллергического синдрома (атопический дерматит с выраженным зудом и резистентностью к традиционной терапии, тяжелая бронхиальная астма). Угнетение нормальной кишечной палочки в анализе кала на дисбактериоз также может говорить о возможном гельминтозе.

С учетом распространенности гельминтозов мы предлагаем анкету для определения риска инфицирования гельминтами.

• Купаетесь в пресноводных водоемах.
• Не моете руки перед едой с мылом в горячей воде.
• Употребляете воду из непроверенных источников.
• Употребляете в пищу домашнее сало с прожилками мяса.
• Употребляете в пищу малосольную рыбу.
• Употребляете в пищу слабопрожаренное мясо (с кровью).
• Употребляете в пищу малосольную икру незаводского приготовления.
• Не моете куриные яйца с мылом.
• Не моете бананы, апельсины, мандарины перед употреблением.
• Удобряете огород навозом.
• Употребляете овощи прямо с грядки.
• Употребляете фрукты и ягоды прямо с грядки.
• Употребляете упавшие фрукты.
• Не обдаете всю зелень кипятком для приготовления салатов.
• Храните морковь в песке, взятом в дворе.
• Ходите босыми ногами по траве.
• У членов семьи были глистные инвазии.
• В семье имеется собака или кошка.

За каждый ответ «да » - 2 балла, «иногда » - 1, «нет » - 0. При сумме баллов 0–5 вероятность инфицирования ничтожно мала, 6–12 - возможно инфицирование, 13–25 - высокая вероятность, более 25 баллов - очень высокая. При двух последних результатах необходимы регулярное обследование и, возможно, профилактическое лечение.

Поскольку клинические проявления гельминтозов не всегда специфичны, а в начальних стадиях - неспецифичны, мы предлагаем анкету для пациентов для самодиагностики гельминтозов .

• Бывает зуд в области ануса по утрам.
• Тошнота по утрам при чистке зубов.
• Шелушение пальцев рук или ног со слущиванием пластов кожи.
• Аллергическая сыпь на коже, кожный зуд.
• Шелушение и отечность в области век.
• Повышенная утомляемость, вялость, сонливость.
• Повышенное чувство голода.
• Чувство дискомфорта в животе.
• Снижение массы тела.
• Наличие нескольких хронических заболеваний органов желудочно-кишечного тракта, суставов, бронхолегочной системы.
• Плохое самочувствие, отсутствие официального диагноза, длительное неэффективное лечение.
• Периодический подъем температуры, сопровождающийся мышечными и суставными болями.

Ответ «да » по крайней мере на 2–3 вопроса говорит о высокой вероятности заражения гельминтами.

ВЫВОДЫ

1. На современном этапе нет лабораторных методов исследования на гельминтозы, которые обладают 100% надежностью.

2. Наибольшей достоверностью в диагностике гельминтозов обладают полимеразная цепная реакция и биорезонансная диагностика.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Чаще всего заражение гельминтами происходит через зараженную пищу, воду, а также через немытые руки.

Прямые и косвенные методы диагностики гельминтозов

На сегодняшний день разработано множество методов диагностики гельминтозов, однако всех их можно разделить на две большие группы: прямые и косвенные. К прямым методам диагностики относятся те исследования, которые позволяют непосредственно выявить гельминты, их фрагменты, личинки или яйца. Косвенные методы диагностики гельминтозов основываются на выявлении вторичных изменений, характерных для той или иной разновидности гельминтоза.

Самыми популярными прямыми методами диагностики гельминтозов являются макро- и микрогельминтоскопические методы исследований.

Макрогельминтоскопические методы исследования

Вопросы читателей

18 October 2013, 17:25 Добрый день. Уже около почти год ощущаю зуд вокруг анального отверстия. Никаких болевых ощущений. Подскажите к кому обратится и что это может быть? Спасибо

Задать вопрос

Микрогельминтоскопические методы исследования

Иммунологические методы исследования

Диагностики гельминтозов основаны на обнаружении в сыворотке крови специфических антител к тем или иным гельминтам. Для иммунологического исследования применяется метод непрямой гемагглютинации, иммуноферментного анализа, иммуноэлектрофореза, иммуноабсорбции и другие серологические методы исследований крови.

Иммунологические методы исследования применяются для диагностики альвеококкоза, эхинококкоза, цистицеркоза, аскаридоза, шистосомоза и других гельминтозов.

Анализ желчи и дуоденального содержимого

Биопсия

Электропунктурная диагностика

Электропунктурная диагностика основана на анализе сопротивления кожи при раздражении ее слабым электрическим током. Электропунктурная диагностика при подозрении на гельминтоз может проводиться двумя способами: по методу Фолля или с помощью резонансного тестирования.

Инструментальные методы исследования

При гельминтозах также проводится ультразвуковое исследование, ФЭДГС, и компьютерная диагностика. Эти методы позволяют определить степень вреда, нанесенного гельминтами, а также определить состояние отдельных органов.

Испражнения исследуются двумя методами:

1. Макроскопический – обнаруживают гельминтов, их головки, членики, обрывки стробилы. Небольшие порции кала, перемешивают с водой в плоской ванночке или чашке Петри и просматривают при хорошем освещении на темном фоне, при необходимости пользуясь лупой. Все подозрительные образования пинцетом переносят в другую чашку с водой или на предметное стекло в каплю разведенного глицерина.

При методе отстаивания исследуемую порцию фекалий размешивают с водой в стеклянном цилиндре, после отстаивания сливают верхний слой воды. Так повторяют несколько раз. Когда жидкость станет прозрачной ее сливают, а осадок просматривают в чашке Петри.

2. Микроскопический – для обнаружения яиц и личинок гельминтов. Существует много методов исследования.

1). Нативный мазок – наиболее распространенный и технически доступный метод исследования. Можно обнаружить яйца и личинки всех гельминтов. Однако, при небольшом количестве яиц их не всегда удается найти. Поэтому используется метод обогащения.

1). Метод Фюллеборга – это метод обогащения, основан на всплытии яиц гельминтозов в насыщенном растворе NaCl (1,2 – плотность; 400 г NaCl на 1 литр воды; 40% раствор NaCl). Метод более эффективен, чем нативный мазок. В стеклянные банки помещают 2-5 г фекалий и заливают раствором NaCl, размешивают и через 45 минут снимают образовавшуюся пленку металлической петлей, помещают каплю глицерина на предметное стекло. Исследуют под микроскопом. Недостаток метода – замедленное высплывание яиц различных гельминтов, карликовый цепень – через15-20 минут, аскарид – 1,5 часа, власоглав – 2-3 часа.

2) Метод Калантарян – также метод обогащения, но применяется насыщенный раствор NaNO 3 (1,38 плотность). Большинство яиц всплывает, не требуется исследования осадка. Недостаток – длительное выдерживание яиц в растворе, приводит к тому, что некоторые яйца начинают набухать и оседать на дно, исчезая с поверхностной пленки.

3. Метод Горячева – основан на принципе осаждения яиц, обнаружения мелких яиц трематод. В качестве раствора используют насыщенный раствор NaCl и сверху осторожно наслаивают 3-4 мл раствора фекалий. Через 15-20 часов яйца трематод оседают на дно. Жидкость сливают, осадок на предметное стекло и под микроскоп.

4. Метод закручивания по Шульману – для обнаружения в кале личинок гельминтов. Исследуют только свежевыделенные фекалии. 2-3 г помещают в стеклянную банку и приливают 5-кратное количество воды, быстро размешивают палочкой, не касаясь стенок банки – 20-30 минут, затем палочку быстро вынимают, и каплю жидкости на конце переносят на предметное стекло и микроскопируют.

5. Метод Бермана – основан на способности, личинок гельминтов мигрировать, по направлению к теплу, и служит для выявления их в фекалиях.

6. Метод Харада и Мори (метод выращивания личинок) и рекомендуется для исследования на анкилостомитозы. Метод основан на том, что в тепле и на влажной фильтрованной бумаге из яиц анкилостомид развиваются филяриевидные личинки, которые легко можно обнаружить. На середину полоски фильтрованной бумаги наносят 15 г кала, бумагу с фекалиями помещают в банку, так, чтобы нижний конец был погружен в воду, а верхний закреплен пробкой. Банку выдерживают в термостате 28 0 С в течение 5-6 дней. Филяриевидные личинки развиваются за это время и спускаются в воду. Жидкость исследуют под лупой. Если трудно обнаружить, жидкость центрифугируют, убив предварительно личинок нагреванием до 60 0 . Лаборант должен работать в перчатках.

7. Методы на энтеробиоз – выявление яиц острицы и бычьего цепня.

а) соскоб с перианальных складок – ватным тампоном, туго намотанным на деревянную палочку и смоченную 50% раствором глицерина. В лаборатории тампон смывают 1-2 каплями 50% водным раствором глицерина.

б) метод липкой лепты (метод Грэхэма)

Липкую ленту прикладывают к перианальным складкам, затем липким слоем к предметному стеклу и микроскопируют.

В) соскоб с помощью глазных палочек (метод Рабиновича). Для перианального соскоба используют стеклянные глазные палочки, широкая часть которых покрывается специальным клеем, что позволяет удерживать яйца остриц.

Исследование крови, желчи, мокроты и мышц

Микроскопия крови – обнаруживают личинки филярий.

Исследование мокроты – яйца параганима, личинки аскариды, некатора, стронгилоида, элементы эхинококкового пузыря.

Исследование мышц – при подозрении на трихинеллез исследуют мышцы больного или трупа, а также мясо, предположительно послужившего причиной заражения человека. С целью трихинеллоскопии мышцу разрезают на мелкие кусочки и помещают в компрессорий, это два широких, толстых стекла, которые раздавливают мышцы и личинки трихинеллы обнаруживаются в виде капсул – метод компрессии.

Метод переваривания – мышцы заливают искусственным желудочным соком (раствор соляной кислоты и пепсин). Мышцы перевариваются, а личинки легко выявляются. Определение интенсивности инвазии: количество личинок до 200 на 1 г мышечной ткани – умеренная интенсивность инвазии; до 500 – интенсивная; свыше 500 – сверхинтенсивная инвазия.

Серологические методы

При обнаружении яиц гельминтов на различных объектах окру­жающей среды (почва, вода, овощи и др.) всегда необходимо опре­делять их жизнеспособность по внешнему виду, окрашиванием ви­тальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы, т.е.

Скармливанием лаборатор­ным животным.

Определение жизнеспособности яиц или личинок гельминтов по внешнему виду. Яйца гельминтов микроскопируют вначале при ма­лом, затем при большом увеличении. У деформированных и мерт­вых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плаз­ма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдви­нуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, ко­торые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней час­ти тела, по мере их гибели зернистость распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли - так называемые нитки жемчуга.

Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власо­главов, остриц следует вызывать активные движения личинок лег­ким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жиз­неспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.

У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отсло­ившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце ли­чинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнару­живается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от места их нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зер­нистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются ва­куоли, а на кутикуле - разрывы.

Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина 0,5 г, натрия бикарбоната 0,09 г, дистиллированной воды 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36-38 “С на 4 ч. При этом живые зародыши осво­бождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также раство­ряются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6-8 ч в термостате при 38 °С.

Если поместить яйца тениид в 1 % раствор натрия сульфида, или 20 % раствор натрия гипохлорида, или же в 1 % раствор хлорной воды при 36-38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 сут. Незрелые и мертвые он­косферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем «растворяются» в течение 10 мин - 2 ч. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1 % раствора натрия хлорида, 0,5 % раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36- 38 °С.

Жизнеспособность сколексов эхинококков определяют при сла­бом нагревании. Для этого отмытые в воде сколексы или выводко­вые капсулы помещают в каплю воды на предметное стекло с лу­ночкой, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроско­пом с нагревательным столиком при температуре 38-39 °С. Если отсутствует нагревательный столик, препарат подогревают при помощи любого источника тепла. При этом жизнеспособные ско­лексы активно двигаются, сокращая или расслабляя присоски, уд­линяя и укорачивая хоботок. Если поместить сколексы в 0,5-1 % водный раствор филицилена при комнатной температуре, то все жизнеспособные сколексы быстро вывернутся и погибнут. Нежиз­неспособные сколексы при этом не вывертываются.

Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на расте­ниях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки тремато­ды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.

Жизнеспособность яиц карликового цепня определяют по распо­ложению крючьев на зародыше.

В живых яйцах карликового цепня происходят вялые маятнико­образные движения протоплазмы и почти незаметные раздвигания и сдвигания заостренных концов латеральной пары крючьев в сто­роны от средней пары.

Сокращения протоплазмы зародыша и зародышевых крючьев помогают зародышу освободиться сначала от оболочек онкосферы, а затем и от наружной оболочки яйца.

В живом яйце медианная пара и боковые пары крючьев распо­ложены параллельно, в некоторых яйцах лезвия боковых пар сбли­жены и расположены по отношению к средней паре крючьев под углом менее 45°.

Погибающий зародыш конвульсивно сокращается и вяло раздви­гает крючья. В погибшем зародыше движение крючьев прекраща­ется, и они располагаются в беспорядке, иногда же латеральные по отношению к соседней паре крючья бывают раздвинуты под пря­мым, тупым или острым углом.

Иногда наблюдаются сморщивание зародыша, образование зер­нистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5-10 до 38-40 °С.

Определение жизнеспособности незрелых нематод следует изу­чать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3 % раствор формалина, приготовленный на изотоническом раство­ре натрия хлорида при температуре 24-30 °С, яйца власоглавов в 3 % раствор соляной кислоты при температуре 30-35 °С, яйца ост­риц в изотонический раствор натрия хлорида при температуре 37 “С. Чашки Петри следует открывать 1-3 раза в неделю для луч­шей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.

Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2-3 мес свиде­тельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гель­минтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых суток развивает­ся до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д.

Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (вы­сотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из рав­ных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консис­тенции, осторожно наливают на дно цилиндра при помощи стеклян­ной трубки. В течение 1-2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25-30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личин­ки, а через 5-7 сут они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооружен­ным глазом. Естественно развивающиеся в воде яйца трематод, на­пример описторхов, дифиллоботриид, фасциол и др., помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают неболь­шой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол сле­дует учесть, что они быстрее развиваются в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22-24 °С через 9-12 сут формиру­ется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц тре­матод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету. При культивирова­нии воду меняют через 2--3 сут.

Личинки анкилостомид и стронгилоид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После нахождения в термостате при температуре 26-30 °С в течение 5-6 сут личинки расползают­ся по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий (метод Фюллеборна).

Метод Harada и Mori (1955). В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой бе­рут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровально# бумаге (15X150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Верхний конец накры­вают куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На про­бирке пишут номер и фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят в течение 8-10 сут при температуре 28 °С. Для изучения культуры снимают и удаляют целлофановую покрышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу филь­тровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под повер­хность целлофана.

Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 мин, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а оса­док переносят на предметное стекло, накрывают покровным стек­лом и микроскопируют под малым увеличением.

Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок не­обходимо пользоваться данными, представленными в табл. 13.

Методы окрашивания яиц и личинок гельминтов. Мертвые тка­ни в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем жи­вые. Эти особенности используют в гельминтологии для определе­ния жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдель­ных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.

Таблица 13. Дифференциальная диагностика филярневидных личинок A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Для дифференциального распознавания живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.

Для окраски живых и мертвых тканей используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцируют метиле­новый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.

Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый си­ний в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают, зародыши мертвых яиц окрашива­ются в синий цвет.

Метод окрашивания неприменим для незрелых яиц аскарид и власоглавов; пигментированная оболочка прокрашивается, и поэтому не видно, окрасилась ли зародышевая клетка внутри яйца.

Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10 ООО осуществля­ют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жид­кости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Пре­парат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости, после чего этот же препарат просмат­ривают повторно через 2-3 ч. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 ч. Мертвые ли­чинки окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полно­стью).

Указывается на возможность окраски препаратов раствором йода при определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц. В ка­честве красителя в этом случае используют 5 % спиртовой раствор йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аска­ридий в течение 1-3 с окрашиваются в оранжевый цвет. Мертвые яйца описторха и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раство­ром толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10 000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают сафранином (в разведе­нии 1:10 000 10 % раствора спирта). Спирт удаляет краску с оболо­чек, а сафранин придает им красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет, зародыш у мертвых - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином либо в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000 или же индигокармином в разведении 1:1000-1:2000.

Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2-7 ч.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня ре­комендуется использовать следующие краски: 1) бриллианткрезиловый синий (1:8000) - через 1 ч у мертвых яиц особенно ярко окра­шивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бес­цветном фоне остального яйца; 2) сафранин: в разведении 1:8000 при воздействии в течение 2 ч и 1:5000 - в течение 3-5 ч; 3) 50 % ра­створ пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 ч при температуре 29-30 “С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).

Живые плероцеркоиды лентеца широкого очень хорошо прокраши­ваются водным раствором (1:1000) нейтральрот в течение 5-20 мин. Для получения стойкой розовой окраски, не исчезающей в течение 5 сут и не влияющей на подвижность плероцеркоидов, обычно дос­таточно 10 мин. Степень окраски контролируют путем просмотра личинок в чистом изотоническом растворе натрия хлорида, для чего плероцеркоидов периодически извлекают из краски. Целесообраз­но применять метиленовый синий для окрашивания мертвых пле­роцеркоидов.

Р.Э.Чобанов и др. (1986) предложили методику определения жиз­неспособности яиц и личинок гельминтов с использованием в каче­стве красителя пигмента «рубрин», получаемого при культивиро­вании плесневого гриба Peniciliium rubrum. Для этого используют 3 % водный раствор красителя.

Процесс окраски яиц и личинок завершается через 1,5 ч. Нежиз­неспособные яйца остриц, бычьего и карликового цепней, анкило­стомид, трихостронгилид приобретают интенсивный розовый цвет, личинки анкилостомид и трихостронгилид - красный. Менее яр­кая окраска наблюдается у яиц аскарид и власоглавов, так как, выделяясь из кишечника, они уже имеют темно-коричневый цвет: Жизнеспособные яйца и личинки не окрашиваются.

Физико-химические методы стимуляции выхода мирацвдия из яиц трематод. Методы разработаны С.М.Герман и С.А.Беэром (1984) для определения жизнеспособности яиц описторхов и дикроцелиумов путем воздействия реакционной среды на яйца. Если они живые, происходит выхождение мирацидия. Методы основаны на физико­химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки. Стимуляция достигается воздей­ствием на яйца трематоды специальной реакционной среды в соче­тании с последовательными приемами - созданием перепада тем­ператур, подсушиванием взвеси яиц, воздействием слабого тока жидкости в исследуемой капле, которые способствуют массовому выходу мирацидиев из яиц.

Определение жизнеспособности яиц описторха по методу Герман, Беэра. Взвесь яиц в воде (водопроводной, отстоявшейся) предвари­тельно охлаждают до 10-12 °С. Все последующие операции осуще­ствляют при комнатной температуре (18-22 °С). В центрифужную пробирку вносят одну каплю (примерно 0,05 мл) взвеси, содержа­щей 100-400 яиц. Пробирки ставят в штатив на 5-10 мин, чтобы осадить яйца. Затем узкой полоской фильтровальной бумаги осто­рожно отсасывают излишек воды до полного ее удаления. В пробир­ку добавляют 2 капли среды, встряхивают, содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 5-10 мин, слегка покачивая (или же помещают под фен) для создания слабых токов жидкости в исследуемой капле взвеси. Эта операция, имитирующая перистальтику кишечника моллюска, позволяет активизировать выход мирацидиев. После этого к взвеси добавляют еще 2 капли среды и затем препарат микроскопируют с помощью обычного све­тового микроскопа (Х200). За это время у яиц с жизнеспособным мирацидием должна открыться крышечка, при этом личинка актив­но выходит в среду. Благодаря наличию в ней этанола мирацидий через 3-5 мин обездвиживается, а затем прокрашивается красите­лем, находящимся в среде. В итоге легко обнаруживают и подсчи­тывают мирацидии.

Приготовление реакционной среды. Среду готовят на 0,05 М трис- HCi буфере в оптимальных режимах pH 8,0-9,5. В буфер добавля­ют этанол до 10-13 % и краситель (сафранин, метиленовый синий и другие, работающие в пределах pH) до слабого окрашивания жидкости (например, для сафранина его конечная концентрация составит 1:50 000). Можно использовать и другой буфер, работаю­щий в щелочных пределах pH, например 0,05 М фосфатный (pH 8,5). Следовательно, среда содержит 96 % этанол - 12 частей; краситель (маточный раствор) - 1-10 частей; 0,05 М трис-НС! буфер (pH 8,5-9,5) - до 100 частей. Пример среды: 12 частей 96 % этанола, 1 часть насыщенного раствора сафранина, остальное до 100 частей - 0,05 М трис-HCl буфер, pH 9,5.

Определение жизнеспособности яиц дикроцелиума по методу Гер­ман, Беэра, Стратана. Каплю взвеси, содержащую 100-150 яиц тре­матоды, помещают в центрифужную пробирку на 1-2 мин для осаждения яиц. Затем жидкость осторожно подсушивают с помощью полоски фильтровальной бумаги. Добавляют пастеровской пипет­кой 1-2 капли реакционной среды и инкубируют на водяной бане при 28-30 °С 2-3 мин. Состав среды: 6 частей бутанола, 94 части 0,4 % раствора хлорида натрия или 0,3 % раствора хлорида калия в дистиллированной воде. Яйца в среде переносят пипеткой на пред­метное стекло и оставляют на 1,5-2 ч при комнатной температуре (18-22 °С), при этом каждые 25-30 мин (по мере подсыхания) до­бавляют по 1-2 капли (0,05 мл) раствора бутанола в дистиллиро­ванной воде. После этого препарат микроскопируют при 100-200- кратном увеличении. Жизнеспособность определяют по числу рас­крывшихся яиц с вышедшими мирацидиями. Бутанол проникает через поры оболочки яиц, достигает мирацидиев и активизирует их. Инкубация при отмеченной температуре усиливает этот процесс. Бутанол в концентрации 3-7 % губителен для вышедшего из яйца мирацидия. Перенос взвеси яиц из пробирки на предметное стекло позволяет к моменту выхода мирацидия (через 30-40 мин) снизить концентрацию бутанола за счет улетучивания до безопасного уровня (1,5-0,5 %). Наличие в среде хлорида натрия в концентрации 0,1- 0,5 % (или хлорида калия в концентрации 0,05-0,4 %) обусловли­вает активность вышедшего мирацидия. В отличие от мелких про­зрачных яиц описторха яйца дикроцелиума имеют темноокрашенную оболочку, у них хорошо заметна крышечка, открытая после выхода мирацидия. Поэтому жизнеспособность яиц дикроцелиума удобнее оценивать путем подсчета раскрывшихся яиц, а не окраши­вания и подсчета мирацидиев.

Люминесцентный метод исследования яиц и личинок гельминтов.

Впервые в гельминтологической практике методы люминесцентной микроскопии были применены в 1955 г. При этом сообщалось, что люминесцентная микроскопия дает возможность дифференциро­вать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюо­ресценции использовались не УФ-лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стекла­ми; к осветителю «ОИ-18» применялся специальный набор цветных фильтров.

Было установлено, что живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гель­минтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин,ауролин,сульфат берлерина, трипафлавин,риванол, акрихин и др.).

Неокрашенные живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц обо­лочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболоч­ка, а у мертвых и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.

Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет; у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы. При вторичной люминесценции (при окраске акридиновым оранжевым в разведении 1:10 ООО и 1: 50 ООО от 30 мин до 2 ч) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.

Скорлупа живых и мертвых Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши этих яиц гельминтов излучают «горящий» оранжево-красный свет. Живые личинки ост­риц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают туск­лый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в «горящий» светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, ярко-оранжевый.

При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином - у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от ли­лово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет. Живые яйца трематод Paragonimus westermani и Clonorchis sinensis не люминес­цируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый свет.

Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки строн­гилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мерт­вые - ярко-оранжевым светом. Живые личинки трихинелл не светятся или дают слабое свечение при 10-минутной обработке ра­створами изотиоцианата флюоресцеина, аурамина и др. Флюорохромированные мертвые личинки (в концентрации 1:5000) дают яр­кое свечение.

Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресни­чек, но спустя 10-15 мин после гибели проявляются ярким «горя­щим» светло-зеленым, а затем оранжево-красным светом.