Своевременная диагностика ВИЧ-инфекции становится крайне важной мерой, т. к. ранее начало лечения может во многом предопределить дальнейшее развитие заболевания и продлить жизнь больного . В последние годы наблюдается весомый прогресс в области выявления этой страшной болезни: на смену старым тест-системам приходят более совершенные, методы обследования становятся более доступными, и их точность значительно повышается.
В данной статье расскажем о современных методах диагностики ВИЧ-инфекции, знать которые полезно для своевременного лечения данной проблемы и поддержания нормального качества жизни заболевшего.
Методики диагностики ВИЧ
В России для диагностики ВИЧ-инфекции проводится стандартная процедура, включающая в себя два уровня:
- ИФА тест- система (скрининговый анализ);
- иммунный блоттинг (ИБ).
Также для диагностики могут применяться другие методики:
- экспресс-тесты.
ИФА тест-системы
На первом этапе диагностики для выявления ВИЧ-инфекции применяется скрининговый тест (ИФА), который основан на созданных в лабораториях белках ВИЧ, улавливающих вырабатывающиеся в организме в ответ на инфицирование специфические антитела. После их взаимодействия с реагентами (ферментами) тест-системы изменяется окраска индикатора. Далее эти изменения цвета обрабатываются на специальной аппаратуре, которая и определяет результат выполненного анализа.
Такие ИФА-тесты способны показывать результат уже через несколько недель после внедрения ВИЧ-инфекции. Этот анализ определяет не наличие вируса, а выявляет выработку антител к нему. Иногда, в организме человека выработка антител к ВИЧ начинается через 2 недели поле заражения, но у большинства людей они вырабатываются на более поздних сроках, спустя 3-6 недель.
Существует четыре поколения ИФА-тестов с различной чувствительностью. В последние годы чаще применяются тест-системы III и IV поколения, которые созданы на основе синтетических пептидов или рекомбинантных белков и обладают большей специфичностью и точностью. Они могут использоваться для диагностики ВИЧ-инфекции, мониторинга распространенности ВИЧ и обеспечения безопасности при проверке донорской крови. Точность ИФА-тест-систем III и IV поколения составляет 93-99% (более чувствительны тесты, которые выпускаются в странах западной Европы – 99%).
Для выполнения ИФА-теста проводится забор 5 мл крови из вены пациента. Между последним приемом пищи и анализом должно пройти не менее 8 часов (как правило, он выполняется утром натощак). Такой тест рекомендуется сдавать не ранее, чем через 3 недели после предполагаемого заражения (например, после незащищенного полового акта с новым половым партнером).
Результаты ИФА-теста получаются через 2-10 дней:
- отрицательный результат: указывает на отсутствие инфицирования ВИЧ и не требует обращения к специалисту;
- ложноотрицательный результат: может наблюдаться на ранних сроках инфицирования (до 3 недель), при поздних стадиях СПИДа при выраженном подавлении иммунитета и при неправильно проведенной подготовке крови;
- ложноположительный результат: может наблюдаться при некоторых заболеваниях и при неправильно проведенной подготовке крови;
- положительный результат: указывает на заражение ВИЧ инфекцией, требует проведения ИБ и обращения пациента к специалисту в центр СПИДа.
Почему ИФА-тест может давать ложноположительные результаты?
Ложноположительные результаты ИФА-теста на ВИЧ могут наблюдаться при неправильной обработке крови или у больных с такими состояниями и заболеваниями:
- множественная миелома;
- инфекционные заболевания, спровоцированные вирусом Эпштейна-Барр;
- состояние после ;
- аутоиммунные заболевания;
- на фоне беременности;
- состояние после вакцинации.
При вышеописанных причинах в крови могут присутствовать неспецифические перекрестно реагирующие антитела, выработка которых была спровоцирована не ВИЧ-инфекцией.
В последние годы частота ложноположительных результатов существенно снизилась благодаря применению тест-систем III и IV поколения, которые содержат более чувствительные пептидные и рекомбинантные белки (они синтезируются при помощи генной инженерии in vitro). После начала применения таких ИФА-тестов частота ложноположительных результатов значительно снизилась и составляет около 0,02-0,5%.
Выявление ложноположительного результата не означает, что человек инфицирован ВИЧ. В таких случаях ВОЗ рекомендует провести еще один ИФА-тест (обязательно IV поколения).
Кровь пациента отправляется в референс или арбитражную лабораторию с пометкой «повторить» и исследуется на ИФА тест-системе IV поколения. Если результат нового анализа отрицательный, то первый результат признается ошибочным (ложноположительным) и ИБ не проводится. При положительном или сомнительном результате во время второго теста больному обязательно назначается проведение ИБ через 4-6 недель для подтверждения или опровержения ВИЧ-инфицирования.
Иммунный блоттинг
Окончательный диагноз инфицирования ВИЧ может устанавливаться только после получения положительного результата иммунного блоттинга (ИБ). Для его проведения применяется нитроцеллюлозная полоска, на которую нанесены вирусные белки.
Забор крови для ИБ выполняется из вены. Далее она подвергается специальной обработке и содержащиеся в ее сыворотке белки разделяют в специальном геле по их заряду и молекулярной массе (манипуляция проводится на специальной аппаратуре под воздействием электрического поля). На гель из сыворотки крови накладывают нитроцеллюлозную полоску и проводят блоттинг («промакивание») в специальной камере. Полоска обрабатывается и если в используемых материалах есть антитела к ВИЧ, то они связываются с антигенными полосами на ИБ и проявляются в виде линий.
ИБ считается положительным если:
- по критериям American CDC – на полоске есть две или три линии gp41, p24, gp120/gp160;
- по критериям American FDA – на полоске есть две линии р24, р31 и линия gр41 или gр120/gр160.
В 99,9% случаев положительный результат ИБ указывает на ВИЧ-инфицирование.
При отсутствии линий – ИБ является отрицательным.
При выявлении линий с gр160, gр120 и gр41- ИБ является сомнительным. Такой результат может выявляться при:
- онкологических заболеваниях;
- беременности;
- частых трансфузиях крови.
В таких случаях рекомендуется выполнение повторного исследования при помощи набора другой фирмы. Если же после дополнительного ИБ результат остается сомнительным, то необходимо наблюдение в течение полугода (через каждые 3 месяца проводятся ИБ).
Полимеразная цепная реакция
Тест на ПЦР может определять РНК вируса. Его чувствительность достаточно высока и он позволяет выявлять ВИЧ-инфицирование уже через 10 дней после заражения. В некоторых случаях ПЦР может давать ложноположительные результаты, т. к. его высокая чувствительность может реагировать и на антитела к другим инфекциям.
Данная методика диагностики является дорогостоящей, требует специального оборудования и высокой квалификации специалистов. Эти причины не дают возможности проводить ее при массовом тестировании населения.
ПЦР применяется в таких случаях:
- для выявления ВИЧ у новорожденных, которые родились от ВИЧ-инфицированных матерей;
- для выявления ВИЧ в «периоде окна» или при сомнительном ИБ;
- для контроля концентрации ВИЧ в крови;
- для исследования донорской крови.
Только по тесту ПЦР диагноз ВИЧ не ставится, а проводится в качестве дополнительного метода диагностики для разрешения спорных ситуаций.
Экспресс-методы
Одной из инноваций в диагностике ВИЧ стали экспресс-тесты, результаты которых могут оцениваться уже через 10-15 минут. Наиболее эффективные и точные результаты получаются при помощи иммунохроматографических тестах, основанных на принципе капиллярного потока. Они представляют собой специальные полоски, на которые наносится кровь или другие исследуемые жидкости (слюна, моча). При наличии антител к ВИЧ спустя 10-15 минут на тесте появляются цветная и контрольная полоска – положительный результат. При отрицательном результате – появляется только контрольная полоска.
Как и после тестов ИФА, результаты экспресс-тестов должны подтверждаться анализом ИБ. Только после этого может ставиться диагноз о ВИЧ-инфицировании.
Существуют экспресс-наборы для домашнего тестирования. Тест OraSure Technologies1 (США) одобрен FDA, продается без рецепта и может применяться для выявления ВИЧ. После проведения теста, в случае положительного результата, больному рекомендуется пройти обследование в специализированном центре для подтверждения диагноза.
Остальные тесты для домашнего использования еще не были одобрены FDA и их результат может быть очень сомнительным.
Несмотря на то, что экспресс-тесты по своей точности уступают ИФА-тестам IV поколения, они широко применяются для дополнительного тестирования населения.
Сдать анализы на выявление ВИЧ-инфекции можно в любой поликлинике, ЦРБ или в специализированных СПИД-центрах. На территории России они проводятся абсолютно конфиденциально, или анонимно. Каждый пациент может рассчитывать на получение медицинской или психологической консультации до или после проведения анализа. Платить за тесты на ВИЧ придется только в коммерческих лечебных учреждениях, а в государственных поликлиниках и больницах они выполняются бесплатно.
О том, какими путями можно заразиться ВИЧ-инфекцией и какие мифы существуют о возможностях заразиться, читайте в
Кровь забирают из вены. Затем исследование проходит по инструкции:
- образец помещают в гель для электрофоретического разделения, в результате получают специфические белки, чувствительные к вирусу;
- на обработанный гель накладывается нитроцеллюлозная бумага;
- подготовленный образец помещают в аппарат для блоттинга.
Чтобы выявить специфические ферменты, необходимо правильно подготовить бумагу для лабораторного исследования. Для этого на нее наносят антитела и меченый радиоактивный конъюгат. Результат исследования оценивают визуально, исследуют построенные цепочки ферментов.
Расшифровка результатов
После проведенных манипуляция на бумаге остаются полосы. Они располагаются там, где произошла конъюгация, то есть нанесенный препарат вступил в реакцию с протеином вируса. Таким образом можно обнаружить части белка:
- из сердцевины ВИЧ-1 – р17, р24, р55;
- возбудителя ВИЧ-2 – р16, р26, р56.
Результаты иммуноблоттинга считаются положительными, если обнаружено 2 из 3 протеина ВИЧ-1 или ВИЧ-2. Так как часто вестерн-блот (второе название исследования) используют для подтверждения положительного ИФА, то реакцию проверяют на специфические протеины: gp120/160, gp41 или р24. Они являются частью трех основных генов СПИДа – gag, pol, and env. При первичной диагностике проверка проводится только на белки р25, gp110/120 и gp160, если она дала положительный результат, то проверку проводят на р24. Эта часть белка позволяет обнаружить вирус на ранней стадии.
Положительный результат – повод обратиться за более сложной диагностикой. Он бывает ложным только в 3-х случаях:
- у пациентов с высоким уровнем билирубина;
- при контакте с вирусными антигенами;
- при патологиях соединительной ткани.
Если у пациента нет линий, соответствующих белкам СПИДа, то результат оценивают как отрицательный. Это означает, что человек не заражен ВИЧ или он находится в «периоде окна». Последнее означает, что вирус мог попасть в организм, но еще не развиться в нем. Чтобы повысить точность диагностики, используются тест-системы:
- Рекомбинат-ВИЧ;
- Антиген;
- Пептоскрин.
После проверки на них результат засчитывается за отрицательный, если в образце не найдены белки gp120, gp160, Sp4.
Есть еще один вариант интерпретации – нейтральный или сомнительный результат. Он встречается у тех, кто вступил в сексуальный контакт с ВИЧ-инфицированным партнером. В их крови находят антитела к белкам gp120 и gp160. Также сомнительный ответ при блоттинге дают, когда инфекция протекает бессимптомно, то есть находится в спящем состоянии.
Сомнительный результат важно подвергнуть тщательной проверке. Для этого используют исследование сыворотки крови в динамике, то есть регулярные проверки методами иммунноблоттинга и ИФА в течение полугода. Также назначаются дополнительные обследования, так как присутствие в крови аутоантител и иммунных комплексов может быть обусловлено:
- инфекционными заболеваниями;
- наличием раковых опухолей;
- аллергией.
Отличительные особенности:
- Набор реагентов «МПБА - Блот - ВИЧ-1, ВИЧ-2» содержит очищенные лизатные вирусные белки ВИЧ 1 и пептид - антигенную детерминату gp36 ВИЧ-2;
- Обеспечивает обнаружение антител к ВИЧ-1, ВИЧ-1 группы О, ВИЧ 2 на одном стрипе;
- Простая процедура подготовки и проведения анализов;
- Внутренний контроль качества прохождения реакции*
- Максимальная скорость проведения анализа (3 часа);
- Небольшой объем исследуемого образца - 20 мкл;
- Не требует дополнительного оборудования для проведения исследований;
- Качество набора гарантировано применением российских и международных стандартных образцов**
* Внутренний контроль качества обеспечивается наличием:
- полосы внутреннего контроля, обеспечивает контроль внесения образца сыворотки или плазмы;
- контрольной отрицательной сыворотки (К-);
- контрольной положительной сыворотки (К+), позволяющей идентифицировать полосы, выявляемые на стрипе;
- контрольной слабоположительной сыворотки (К+сл), которая обеспечивает контроль чувствительности набора реагентов.
**Гарантия качества:
Характеристики набора реагентов «МПБА-Блот-ВИЧ-1, ВИЧ-2» определялись при тестировании образцов случайной выборки доноров, пациентов с диагнозом ВИЧ инфекция, коммерческих сероконверсионных панелей, стандартных панелей, и образцов с «потенциально мешающими определению» компонентами.
Набор реагентов не дает ложноположительных результатов при исследовании сывороток стандартной панели, не содержащих антитела к ВИЧ 1,2 и антигена ВИЧ-1(«Стандарт АТ (-) ВИЧ», № ФСР 2007/00953 от 25.10.2007 г.). Специфичность - 100 %.
Диагностическая специфичность определялась при исследовании случайной выборки 200 доноров из различных центров крови и клиник с предварительно подтвержденным отсутствием инфицирования ВИЧ-1, ВИЧ-2. Специфичность при исследовании случайной выборки доноров составила 100%;
Специфичность набора реагентов определялась при исследовании 250 образцов, включающих в себя образцы сыворотки или плазмы, полученные от беременных женщин, госпитализированных пациентов, больных гепатитом С и Е и образцы с «потенциально мешающими определению» компонентами. При использовании набора «МПБА-Блот-ВИЧ-1, ВИЧ-2» для данных образцов не было обнаружено ложно-положительных результатов.
Диагностическая чувствительность определялась с использованием:
- образцов плазмы панели Boston Biomedica, Inc HIV-1 (WWRB 301) из разных регионов, содержащих различные подтипы ВИЧ-1: группа М (субтипы A, B, C, D, E, F), и группа О; чувствительность набора реагентов составила 100%;
Чувствительность набора реагентов определялась при исследовании международных сероконверсионных панелей Boston Biomedica, Inc (SeraCare Life Sciences), cat. nrs. PRB 903, PRB 904, PRB 909, PRB 912, PRB 916, PRB 917, PRB 918, PRB 919, PRB 921, PRB 923, PRB 924, PRB 927, PRB 928, PRB 932, PRB 940.
Набор реагентов выявляет антитела к ВИЧ-1 в сыворотках стандартной панели, содержащей антитела к ВИЧ-1 («Стандарт АТ (+) ВИЧ-1», № ФСР 2007/00953 от 25.10.2007 г.), выявляет антитела к ВИЧ-2 в сыворотках стандартной панели, содержащих антитела к ВИЧ-2 («Стандарт АТ (+) ВИЧ-2», № ФСР 2007/00953 от 25.10.2007 г.). Чувствительность - 100%.
Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/07958 от 13 июля 2011 г. (срок действия не ограничен)
Состав:
- Иммуносорбент. Стрипы из нитроцеллюлозной мембраны белого цвета с сорбированными на них методом электропереноса индивидуальными белками ВИЧ-1 (gp160, gp120, р66, р55, р51, gp41, р31, р24, р17) и нанесенными на стрип синтетическим пептидом ВИЧ-2, аналогом белка gp36 и анти-IgG-человека (внутренний контроль) - 18 шт;
- К- - контрольная отрицательная сыворотка. Сыворотка крови человека, не содержащая антитела к ВИЧ-1,2, ВГС, антиген ВИЧ, HBsAg, инактивирована прогреванием при 560С; прозрачная светло-желтая жидкость - 1 пробирка (0,08 мл). Содержит консерванты: тимеросал и азид натрия;
- К+ - контрольная положительная сыворотка. Сыворотка крови человека, содержащая антитела к ВИЧ-1,2 (титр не менее 1:10000), не содержащая HBsAg, антиген ВИЧ, антитела к ВГС, инактивирована прогреванием при 560С; прозрачная светло-желтая жидкость - 1 пробирка (0,08 мл).Содержит консерванты: тимеросал и азид натрия;
- К+сл - контрольная слабоположительная сыворотка. Сыворотка крови человека, содержащая антитела к ВИЧ-1,2 (титр не более 1:200), не содержащая HBsAg, антиген ВИЧ, антитела к ВГС, инактивирована прогреванием при 560С; прозрачная светло-желтая жидкость - 1 пробирка (0,08 мл). Содержит консерванты: тимеросал и азид натрия;
- РРОКк (х10) - раствор для разведения образцов и конъюгата. Концентрат - трис-буфер, содержащий предварительно обработанную нормальную козью сыворотку; непрозрачная серая жидкость - 1 флакон (10 мл). Содержит консервант: тимеросал;
- ПРк (х20) - промывочный раствор. Концентрат - трис-буфер, содержащий Твин-20; прозрачная бесцветная жидкость - 1 флакон (70 мл). Содержит консервант: тимеросал;
- Коньюгат. Козьи антитела к IgG человека, конъюгированные со щелочной фосфатазой; прозрачная бесцветная жидкость - 1 пробирка (0,06 мл);
- Субстрат (окрашивающий раствор). Раствор 5-бром-4-фторо-индолил-фосфата (BCIP) и нитросинего тетразолия (NBT); прозрачная светло-желтая жидкость - 1 флакон (50 мл);
- Порошок для иммунного блоттинга. Обезжиренное сухое молоко - аморфный белый или светло-желтый порошок - 5 уп х 1г;
- Планшет с крышкой для постановки реакции - 2 штуки;
- Пинцет пластмассовый - 1 штука.
Иммуноблоттинг – (от англ. «blot» – пятно) – метод идентификации антигенов (или антител) с помощью известных сывороток (или антигенов). Представляет собой сочетание гель-электрофореза с ИФА. Первоначально бактериальные клетки или вирионы разрушают при помощи ультразвука, а затем методом электрофореза разделяют все антигены вируса или бактериальных клеток и получают коммерческий реагент на специальной нитроцеллюлозной плёнке. При постановке иммуноблоттинга на плёнку с известными антигенами наносится исследуемая сыворотка пациента. После инкубации и отмывания несвязавшихся антител, приступают к ИФА – на плёнку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов антиген-антитело-антисыворотка к иммуноглобулину-фермент на носителе появляются окрашенные пятна. Метод иммуноблоттинга позволяет отдельно обнаружить антитела на различные антигены возбудителя (например, при ВИЧ-инфекции иммуноблоттинг выявляет антитела на gp120, gp24 и другие антигены вируса).
Радиоиммунный анализ (РИА)
В основе метода лежит реакция антиген-антитело с применением метки антигена или антитела радионуклидом. В качестве метки используются 125I, 14C, 3H, 51Cr и другие радионуклиды. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счётчиках (β-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
Широко распространён твёрдофазный вариант РИА с использованием меченых антител или антигенов, сорбированных в лунках полистироловых панелей.
РИА применяют для выявления антигенов микробов, вирусов, различных гормонов, ферментов, лекарственных веществ, иммуноглобулинов, а также других веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях 10-12–10-15 г/л.
Контрольные вопросы
Реакция иммунного бактериолиза: что это за реакция; что является антигеном, что – антителами, механизм реакции, методы постановки, практическое применение. Реакция иммунного гемолиза: необходимые ингредиенты, методика постановки; контроли, практическое применение. Реакция локального гемолиза в геле (реакция Йерне): принцип реакции, методика постановки, практическое применение. Реакция связывания комплемента: принцип реакции; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? С помощью какой реакции можно определить, что произошло с комплементом; почему используется именно эта реакция; каков видимый положительный результат РСК? Почему? Какое свойство комплемента используется в первой фазе РСК? Во второй фазе? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает – положительный или отрицательный результат? Объясните результаты: РСК+ + + +, РСК+ + +, РСК+ +, РСК+. Назовите ингредиенты первой системы РСК и ингредиенты второй системы РСК. Почему исследуемую сыворотку необходимо инактивировать? Как титруют комплемент? Гемолитическая сыворотка: что она содержит, как её получают, что такое титр и как его определяют? Какие животные используются для получения компонентов РСК? Методика постановки РСК на холоде. При постановке каких из перечисленных реакций необходимо участие комплемента: преципитации, флоккуляции, агглютинации, выявления неполных антител, иммунного бактериолиза, иммунного гемолиза, Йерне, РСК? Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – укажите последовательность событий при прямой реакции Кунса; необходимые ингредиенты. Что является антигеном, что – антителами, чем помечены антитела, как учитывается результат реакции, как выглядит положительный результат? Практическое применение – что можно определить с помощью этой реакции? Непрямая реакция иммунофлюоресценции – укажите последовательность событий при этой реакции, необходимые ингредиенты, что является антигеном, какие иммунные сыворотки применяются; практическое применение; преимущество непрямой РИФ по сравнению с прямой реакцией. Иммуноферментный анализ (ИФА) – принцип реакции; необходимые ингредиенты; укажите последовательность событий при постановке реакции с целью обнаружения антигена в исследуемом материале; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате, как он выглядит? Укажите последовательность действий при постановке ИФА с целью обнаружения антител в исследуемой сыворотке; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате? Иммуноблоттинг – принцип реакции; основные этапы; необходимые ингредиенты; как учитывается результат; преимущества реакции. Радиоиммунный анализ (РИА) – из каких основных этапов складывается реакция; чем помечены антитела или антигены, как учитывается результат? Иммуноэлектронная микроскопия – принцип метода; основные этапы; необходимые ингредиенты; чем помечены антитела; как учитывается результат реакции. Реакции иммобилизации – принцип метода, техника постановки, компоненты, учёт результатов.
Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
Заполните таблицу «Реакции иммунитета» в отношении реакций, разбираемых в рамках данной темы.
Реакции иммунитета
Работа студента на практическом занятии
Работу начать сразу с постановки 1 фазы РСК, но в тетрадь записать позже (см. ниже).
1. Реакция иммунного гемолиза. Посмотреть демонстрационную реакцию иммунного гемолиза, зарисовать в виде схемы, объяснить результат в опытной и в контрольных пробирках.
2. Реакция связывания комплемента
а) разобрать РСК по таблице;
б) начертить в тетрадь схему постановки РСК в виде таблицы;
в) поставить вторую фазу РСК (первая фаза ставится в начале занятия);
г) разобрать диагностические препараты, необходимые для РСК;
д) учесть результат. Сформулировать вывод о наличии специфических антител в исследуемой сыворотке.
3. Реакция иммунофлюоресценции. Изучите таблицу, составьте в тетради схему постановки реакции; посмотрите диагностические сыворотки; определите – что содержит сыворотка, как приготовлена, для какой реакции (прямой или непрямой РИФ) она применяется. Посмотрите демонстрационный результат РИФ в люминесцентном микроскопе.
4. Иммуноферментный анализ (ИФА). Составьте в тетради схему постановки реакции в двух вариантах: для обнаружения антигена в исследуемом материале и для обнаружения антител в сыворотке. Ознакомьтесь с набором ингредиентов для диагностики ВИЧ-инфекции и гепатита В. Определите, что содержит каждый ингредиент и для чего он применяется.
5. Иммуноблоттинг. Составьте в тетради схему постановки реакции; посмотрите демонстрацию – результат реакции.
6. Радиоиммунный анализ (РИА). Составьте в тетради схему реакции.
7. Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ). Посмотрите демонстрацию – результат реакции, составьте в тетради схему реакции, укажите стрелками антиген (вирус) и меченые антитела.
Иммуноблоттинг - высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.
В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией.
Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесенную на подложку, — дот-блот анализ — либо после ее предварительного фракционирования методами электрофокусирования, диск-электрофореза или двумерного электрофореза — Вестерн-блот анализ (Western blotting).
Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА.
Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс (антиген + антитело больного + антитело против Ig человека) выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.
Такая методология применяется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продукты целевых клонированных генов.
Перенос белков на мембрану осуществляется либо пассивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факторов, таких как молекулярная масса белков, пористость геля, время переноса и состав используемого буферного раствора (транс-буфера).
В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. В качестве подложек обычно используют нитроцеллюлозные, поливинилидендифлуоридные (ПВДФ) или положительно заряженные нейлоновые мембраны. Нитроцеллюлоза может связывать до 80 — 100 мкг белка на 1 см2.
Низкомолекулярные белки (с молекулярной массой менее 20 кДа) могут быть утеряны в результате промывок ет возможность предварительно исследовать полиморфизм определенных генетических локусов по длинам соответствующих рестрикционных фрагментов ДНК.
Кроме того, с помощью гибридизации по Саузерну можно легко выяснить, имеет ли целевой ген участок гидролиза определенной рестриктазой в своей внутренней части, что позволяет выбирать оптимальную стратегию клонирования изучаемого района генома.
По аналогичной схеме из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр можно перенести и молекулы РНК. Этот метод был назван Северным блоттингом (Northern blotting) в противоположность блоттингу по Саузерну (Southern blotting), так как фамилия Саузерн в английском языке означает «южный».
Перенос на фильтры из геля белков соответственно назвали Западным блоттингом (Western blotting). Крупные белки (более 100 кДа), денатурированные в растворе додецилсульфата натрия (SDS), могут слабо переноситься на мембрану, если в транс-буфере присутствует этанол. Спирт значительно улучшает перенос белков с SDS-полиакриламидного геля, но сужает поры в геле, что и приводит к задержке крупных белков.
Мембрана ПВДФ оптимизирована для проведения иммунодетекции и способна удерживать специфически связавшиеся белки до 160 мкг/см2 при очень низком уровне неспецифического связывания.
Иммуноблоттинг
Немаловажное свойство этой мембраны — возможность ее многократного использования. Нейлоновые мембраны Zeta-Probe эффективно связывают SDS-белки в отсутствие спирта, причем это связывание устойчиво к последующим обработкам. Низкомолекулярные белки также удерживаются эффективно. Благодаря высокой связывающей емкости — около 480 мкг белка на 1 см2 — мембраны Zeta-Probe позволяют обнаруживать следовые количества белка в анализируемых смесях.
После того как антиген оказывается иммобилизованным на мембране, оставшиеся центры связывания блокируют растворами желатина, либо бычьего сывороточного альбумина, либо обезжиренного молока.
Затем мембрану инкубируют в растворе поликлональных или моноклональных антител к исследуемому анти гену. После отмывки несвязавшихся антител мембрану инкубируют в растворе вторичных антител, которые представляют собой конъюгат ферментов щелочной фосфатазы (alkaline phosphatase, АР) или пероксидазы хрена (horseradish peroxidase, HRP) с антивидовыми антителами (козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, мыши или человека) либо белками А (белок Staphylococcus aureus) или G (белок Streptococcus sp.), имеющими высокую аффинность к Fc-области иммуноглобулинов.
Детекцию образованных иммунных комплексов проводят химическим или хемилюминесцентным способом. Субстратами для химической реакции при использовании конъюгатов щелочной фосфатазы служат 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) или тетразолий голубой (NBT), а при использовании конъюгатов пероксидазы хрена — 4-хлор-1-нафтол и перекись водорода.
В результате ферментативных реакций на мембране образуется окрашенная полоса или пятно в месте локализации комплекса антиген-антитело.
Чувствительность данного метода составляет 100 пг белка при использовании конъюгатов АР и 100-500 пг при использовании конъюгатов HRP. Хемилюминесцентная детекция иммунных комплексов позволяет определять менее 5 пг антигена. Принцип этого метода заключается в том, что при реакции HRP с перекисью водорода и циклическим диацилгидразинлюминолом происходит эмиссия света длиной волны 428 нм, которая может быть зафиксирована на светочувствительной пленке.
Реакция иммуноблотинга (РИ) разработана на основе ИФА. Является самым специфичным и чувствительным методом иммунохимического анализа. Иммуноблотинг (от англ. blot – промокать, пятно) сочетает ИФА с электрофорезом. Применяется для выявления не комплексных антител к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (белки-р24, гликопротеины-gр120, gр 41 и др.). Относятся к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции.
Реакция проводится в несколько этапов:
Вирус разрушают на компоненты — антигены (р24, gр120, gр 41 и др.), которые подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле, то есть разделению антигенов на фракции по молекулярной массе.
2. Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной и на неё при помощи электрофореза переносятся фракции антигенов. Нитроцеллюлоза ведёт себя подобно промокательной бумаге. Мембрану разрезают на полоски (стрипы). Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов.
Иммуноблоттинг - дополнительный непрямой метод
Стрипы с нанесёнными на него антигенами ВИЧ погружают в сыворотку обследуемого и затем отмывают от несвязавшегося материала.
4. Стрипы инкубируют антиглобулиновой сывороткой, меченой пероксидазой, отмывают.
Добавляют субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен), которые соответствуют в зоне локализации комплекса АГ-АТ.
Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ. Результат иммуноблоттинга считается положительным, если на мембране видны полосы, соответствующие любым двум из трех антигенов ВИЧ - р24, gp41 и gp 120 (рис.37).
РИСУНКИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Основная литература
Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов мед. вузов 2-е изд., испр. и доп. — 702 с. Под ред. А.А. Воробьева. М. : МИА, 2012.
2. Микробиология, вирусология и иммунология: руководство к лабораторным занятиям: учеб.пособие/(В.Б.Сбойчаков и др.); под ред. В.Б.Сбойчакова, М.М.Карапаца. – М.:ГЭОТАР-Медиа, 2014.- 320с.:ил.
3. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология [Электронный ресурс]: учебник для мед.
вузов — 760 с. — Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Коротяев А.И., Бабичев С.А. СПб.: Спецлит, 2010.
4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс] : учебник: в 2 т. / Т. 1. — 448 с. — Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Зверев В.В., Бойченко М.Н.
М. : Гэотар Медиа, 2010. .
5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс]: учебник: в 2 т. Т. 2. — 480 с. Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Зверев В.В., Бойченко М.Н. М. : Гэотар Медиа, 2010.
Дополнительная литература
1. Иммунодиагностические реакции: учебное пособие / сост.: Г.К.Давлетшина, З.Г.Габидуллин, А.А.Ахтариева, М.М.Туйгунов, А.К.Булгаков, Т.А.Савченко, Р.Ф.
Хуснаризанова, Ю.З.Габидуллин, М.М.Алсынбаев – Уфа: Изд-во ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, 2016. — 86с.
2. Особенности некоторых свойств, определяющих патогенный потенциал сокультивируемых вариаций бактерий Еnterobacter, Сitrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: научное издание / Ю. З. Габидуллин, Р. С. Суфияров, И. И. Долгушин – Уфа, 2015. – 250 с.
Главная » Иммуноблот – что это? Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний
Иммуноблот – что это? Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний
Что такое иммуноблот? Это распространенный метод лабораторной диагностики вирусных инфекций человека. Он является одним из наиболее точных и надежных способов обнаружить наличие ВИЧ.
Для надежности он даже больше, чем энзим-соединенный assay иммуносорбента (elisa). Результаты иммуноблот считается неопровержимой и окончательной.Общая информация
Иммуноблот – что это? Для того, чтобы признать человека ВИЧ, вы должны пройти лабораторный метод исследования сыворотки крови на наличие антител.
Методом Вестерн-блот разделы также называется Вестерн-блот (вестерн блот). Он используется для обнаружения вирусных инфекций человека, в качестве дополнительного экспертного метода. Это необходимо для подтверждения ИФА – лабораторное исследование, позволяющее определить в крови наличие антител к ВИЧ. Иммуноблот перепроверить положительный ИФА.
Он считается наиболее чувствительным, сложным и дорогим.
Цель
Что такое иммуноблот? Эта методика лабораторных исследований сыворотки крови на наличие антител к вирусу.
В ходе специальных исследований общий вирусных белков в геле и на нитроцеллюлозные мембраны.
Иммуноблоттинг (выявление антител в сыворотках больных к определенным антигенам возбудителя)
Предназначен процедуру Вестерн-блот секций для определения ВИЧ-инфекции на разных стадиях. На первом этапе, очищенный вирус из составных частей подвергается электрофорезом и антигены, входящие в нее, деленной на молекулярный вес.
Вирус иммунодефицита человека размножается в живых клетках, внедренные в его генетической информации. На этой стадии, человек становится носителем вируса ВИЧ, если вы были инфицированы.
Специфика этого заболевания заключается в том, что он долгое время не проявляется. Вирус разрушает лимфоциты, таким образом, у человека снижается иммунитет и организм становится неспособным бороться с инфекциями.
Если ВИЧ-это правильно и своевременно лечить, пациент будет жить до глубокой старости. Отсутствие лечения неизбежно приводит к смерти. С момента инфекции, но без лечения, максимальный срок не более десяти лет.
Особенности
Анализ иммуноблот-это надежный метод, который позволяет определить наличие антител к ВИЧ-антигенам первого и второго типа.
Если человек инфицирован, после двух недель антитела, которые могут быть обнаружены значительно позже. Особенностью ВИЧ является то, что количество антител быстро увеличивается и остается в крови пациента. Даже если они присутствуют, болезнь может никак не проявляться в течение двух или более лет. Метод ИФА не всегда точно указывает на наличие болезни, требующая подтверждения результатов от-ПЦР и Вестерн-блот разделы, если иммуноферментный анализ показал положительный результат.
Показания к
Что это за «иммуноблот» уже выяснили, но которые вводят в исследовании?
Поводом к проверке на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) иммуноблот станет положительным результатом ИФА. Нужно пройти через твердофазного иммуноферментного анализа у больных, которым предстоит операция. Кроме того, вы должны сделать анализ планирующих беременность женщин, а также тех, кто ведет беспорядочную половую жизнь. Вестерн-блот разделах назначают пациентам с ВИЧ-инфекцией, если результаты elisa являются сомнительными.
Поводом для обращения к врачу могут быть следующие тревожные симптомы: быстрая потеря веса;слабость, потеря функции;расстройства кишечника (понос), которая длится три недели;обезвоживание;лихорадка;увеличение лимфатических узлов в организме;развитие кандидоза, туберкулеза, пневмонии, токсоплазмоз, обострение герпеса.
Пациенту не нужно готовиться перед сдачей венозной крови.
За 8-10 часов перед тестом не кушать. Не рекомендуется за день до сдачи крови употреблять алкоголь и кофейных напитков, тяжелых физических упражнений, испытывать волнение.
Где сделать анализ?
Где я могу пройти тестирование на ВИЧ?
ИФА, иммуноблот анализа, проведенного в городских частных клиниках, результаты дают в течение дня. Возможна и срочная диагностика. В общественных учреждениях, медицинских тестов elisa и Вестерн-блот секции бесплатно, в соответствии с законодательством Российской Федерации.
Обязательную проверку на инфекционные заболевания беременных женщин, и больных, нуждающихся в госпитализации или хирургического вмешательства.Как проводится это исследование?
Как провести ИФА? Иммуноблот положительный/отрицательный подтверждает или опровергает результаты elisa. Процедура достаточно простая. Специалист осуществляет забор венозной крови, по времени это занимает менее пяти минут.
После отбора пробы, место инъекции следует продезинфицировать и заклеить пластырем. Забор проводится натощак, поэтому после процедуры не помешает съесть плитку горького шоколада или сладкий горячий напиток.
Чтобы получить направление на бесплатный анализ в государственном медицинском учреждении, необходимо посетить терапевта.
В целом, иммуноблот не отличается от других исследований крови путем забора. Методология исследования проста. Если в крови человека присутствует вирус, организм для его уничтожения начинает вырабатывать антитела. Для каждого вируса существует множество белковых антигенов. Обнаружение этих антител является основой метода Вестерн-блот разделы. Стоимость
Сколько анализ? Иммуноблот ВИЧ относится к дешевым исследований.
В среднем, скрининговые методы иммуноанализа составляет от 500 до 900 рублей. Вестерн-блот разделов является изучение проверки, стоимость которых колеблется от трех до пяти тысяч рублей. Более сложные методы намного дороже. Например, для анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) нужно будет заплатить около 12000 рублей.
Интерпретация результатов
Наиболее распространенные методы диагностики ВИЧ-инфекции является иммуноферментный анализ и иммуноблот.
Они это для определения в сыворотке антител к вирусу иммунодефицита человека. Инфекция обычно подтверждается двух тестов: скрининг и подтверждающий. Интерпретация результатов должна производиться врачом, он диагностирует и назначает лечение. Если иммуноблот положительный, это означает, что в человеческом организме вирус.
Положительный результат не должен стать поводом для самостоятельного лечения, поскольку каждый пациент может иметь свои собственные картины заболевания.
Качественный анализ включает в себя скрининг и сертификационный. Если у пациента не обнаруживается вирус, результат показывает «отрицательно». Когда обнаружен данный сертификат, скрининг проводят дополнительные исследования. Иммуноблот анализ, который подтверждает или опровергает скрининга. Если тест-полоски появляются в потемнение определенных областях (локализация белков), поставлен диагноз «ВИЧ».
Если результаты сомнительны, то испытания проводятся в течение трех месяцев.
Чтобы предотвратить заражение вирусом иммунодефицита человека возможно, если соблюдать определенные правила: избегать случайных половых контактов, использовать презервативы при контакте, не употребляю наркотики.
Если заболевание обнаружено у беременной женщины, важно следовать рекомендациям лечащего врача, не забывать о тесты на наличие вируса.
Что такое вестерн-блоттинг?
Идентификация белка всложных смесях или экстрактах различных тканей является одной из часто встречающихся задач. Используя такой инструмент как специфичные антитела, можно определить исследуемый белок с минимумом временных и финансовых затрат.
В методе Вестерн-блоттинг (Western blotting) на первом этапе смесь белков разделяется методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), затем переносится на нитроцеллюлозную мембрану методом электроблоттинга.
Суть данного метода заключается в том, что гель после электрофореза помещается на нитроцеллюлозную мембрану между слоями фильтровальной бумаги. Собранный таким образом «сэндвич» помещается в электрическое поле так, что комплексы белок-ДСН движутся поперек пластины геля и иммобилизуются (в результате неспецифической сорбции) на поверхности нитроцеллюлозной мембраны.
В связывании комплекса белок-ДСН с нитроцеллюлозной мембраной принимают участие в основном силы электрической природы, причем данное взаимодействие является многоточечным и приводит к «распластыванию» белков на поверхности мембраны. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.
После проведения ДСН - электрофореза, электропереноса и сорбции белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану третичная конформация белка сильно изменена, если вообще правильно говорить о существовании третичной структуры для белка после такой жесткой обработки. Поэтому для иммунохимической детекции исследуемого белка обычно используются только моно- или поликлональные антитела, специфичные к линейным участкам белковой молекулы.
51. Иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг. Меха-низм, компоненты, применение.
Антитела, специфичные к конформационным эпитопам (или участкам, включающим в себя межсубъединичные контакты), как правило, не пригодны для использования в методе Вестерн-блоттинг.
После переноса белков мембрану инкубируют последовательно с антителами, специфичными к исследуемому белку, а затем со вторичными антителами, специфичными к Fc-фрагментам первичных антител, конъюгированными с ферментной (или какой-либо другой) меткой (рис.
1 А). В случае, когда с меткой конъюгированы непосредственно первичные, специфичные к исследуемому антигену антитела, вторичные антитела не требуются (рис. 1 Б). Образовавшиеся в месте локализации исследуемого белка иммунные комплексы «проявляются» с помощью хромогенного субстрата (зависит от типа метки).
Чувствительность и специфичность метода сильно зависят от того, какие антитела используются при проведении исследований.
Используемые антитела должны быть специфичны к уникальной, характерной только для исследуемого белка последовательности аминокислот. В противном случае возможно взаимодействие (особенно в случае грубых белковых экстрактов) антител с несколькими белковыми молекулами, что в свою очередь приведет к появлению на мембране нескольких окрашенных полос.
Идентификация исследуемого белка в таком случае часто бывает затруднительной либо вообще невозможной.
Вторым важным фактором, о котором следует помнить при выборе антител, является аффинитет. Чем выше аффинитет используемых антител, тем ярче и четче прокрашиваются белковые полосы, тем выше чувствительность метода. При использовании высокоаффинных антител можно достичь чувствительности 1 нг и даже выше.
Для визуализации результата взаимодействия связанного с мембраной антигена и антител используют вторичные антитела, конъюгированные с агентами, способными в определенных условиях давать определенный сигнал.
Обычно в качестве такого агента используют фермент (пероксидазу или фосфатазу), продукт реакции которого имеет окраску и выпадает на мембране в виде нерастворимого осадка.
Также в данном методе возможно использование флуоресцентных меток.
Рис. 1. Схема иммунохимического окрашивания исследуемого белка: А - с использованием вторичных антител, конъюгированных с ферментной меткой; Б - первичное антитело напрямую конъюгировано с ферментной меткой.
Протокол:
I. Подготовка геля и мембраны и электроперенос белков
Полиакриламидный гель после проведения электрофореза помещают в ванночку с буфером для блоттинга (25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол).
Два листа фильтровальной бумаги, вырезанные по форме кассеты для блоттинга и смоченные буфером для блоттинга, помещают на ту часть кассеты, которая будет обращена к аноду. Затем на фильтровальную бумагу помещают предварительно смоченную тем же буфером нитроцеллюлозную мембрану, следя за тем, чтобы между мембраной и бумагой не было пузырей воздуха.
После этого на мембрану следует осторожно поместить гель, снова обратив особое внимание на отсутствие пузырей воздуха между гелем и мембраной. Завершают формирование сэндвича два слоя смоченной фильтровальной бумаги, которые помещаются на поверхность геля (Рис. 2). Полученный сэндвич зажимается в кассете и помещается между электродами так, чтобы мембрана была обращена к аноду.
Рис. 2. Схема электропереноса белков на мембрану.
II. Электроперенос
Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану проводят в буфере, содержащем 25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол в течение 30-50 мин при постоянном напряжении 100 В.
Время электропереноса зависит от размера переносимых белков, чем больше белок, тем дольше осуществляется электроперенос. Качество электропереноса и расположение белковых полос оценивают, окрашивая нитроцеллюлозную мембрану 0,3% раствором Ponceau S в 1% уксусной кислоте. Перед проведением иммунохимического окрашивания мембрану следует промыть несколько раз слабо щелочным водным раствором Трис для удаления связавшегося с белками красителя.
III. Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране
Для блокирования мест неспецифического связывания антител мембрану инкубируют при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 30 мин в PBST (для лучшей блокировки можно использовать раствор PBST, содержащий 10% сухое обезжиренное молоко).
После блокировки мембрану инкубируют в течение часа при комнатной температуре и постоянном перемешивании в PBST, содержащем 1-10 мкг/мл специфичных антител.
Оптимальная концентрация антител подбирается эмпирически и зависит от аффинности взаимодействия антител с антигеном.
По окончании инкубации мембрану промыть 5 раз PBST и перенести в раствор вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Разведение конъюгата обычно указывается производителем на упаковке, либо подбирается исследователем эмпирически. В растворе вторичных антител мембрану инкубировать 1 час при постоянном перемешивании.
После тщательной отмывки (минимум 5 - 6 раз менять буфер) PBST мембрану переносят в раствор хромогенного субстрата, содержащий 3 мг диаминобензидина (ДАБ) и 10 мкл 30% перекиси водорода в 10 мл 0.1 М трис-HCl, рН 7,6.
Инкубацию проводят при перемешивании 5 - 10 минут. Мембрану после окончания инкубации с субстратом следует промыть PBST, подсушить, промокнув фильтровальной бумагой, и сразу же сделать электронную копию, сканируя в цвете. Если мембрана полностью высыхает, прокрашенные белковые полосы бледнеют, и изображение получается менее ярким и контрастным.
Примечание: ДАБ является токсичным веществом и потенциальным канцерогеном. Работать только в резиновых перчатках!