Большинство генов эукариот, в отличии от генов прокариот имеют прерывистую структуру. Относительно короткие кодирующие участки (экзоны) чередуются с некодирующими участками (интроны). Регуляторные элементы гена - промоторы, определяющие точность инициации, транскрипции, локализованы перед первым экзоном на 5"-конце нити ДНК и представлены несколькими элементами (ТАТА-, ССААТ-боксы, GC-мотив).
Экспрессия генов регулируется также усилителями (энхансеры), ослабителями (сайленсоры), а также инсуляторами (ограничители действия энхансеров) и элементами отклика, взаимодействующими с факторами транскрипции, ксенобиотиками, стероидными гормонами и др. Эти последовательности участвуют в определении частоты инициации транскрипции .
Первый этап реализации генетической информации - транскрипция. Гены эукариот транскрибируются в виде предшественника, который состоит из экзонов и интронов (незрелая иРНК). Затем интроны вырезаются специальными ферментами, а экзоны последовательно сшиваются друг с другом, формируя готовый для трансляции транскрипт (зрелая иРНК). Этот процесс получил название сплайсинга. Одна и та же последовательность ДНК может кодировать несколько различных белков, благодаря так называемому альтернативному сплайсингу (образование разных иРНК за счет изменения чередования соединения экзонов из одного первичного РНК-транскрипта).
После транскрипции или параллельно с ней незрелая иРНК подвергается дальнейшей модификации. К 5"-концу пре-иРНК с помощью фермента присоединяется метилированный остаток гуанина в 7-м положении пуринового кольца (процесс копирования). Считается, что кэп (шапочка) необходима для правильной ориентации и присоединения рибосом к иРНК перед началом трансляции. К З"-концу пре-иРНК также ферментативно присоединяется короткая нуклеотидная последовательность, состоящая из остатков аденина (полиаденилирование). Полагают, что поли-А-последовательность необходима для транспорта иРНК через ядерную мембрану в цитоплазму .
По выполняемой функции в клетке эукариотические гены делятся на несколько групп.
Первую группу составляют гены, экспрессирующиеся во всех типах клеток. Продукты их деятельности - белки, необходимые для обеспечения жизнедеятельности любой клетки организма (гены рибосомальных РНК, гистонов и др.).
Вторая группа - тканеспецифические гены, которые функционируют только в определенных типах клеток или тканях на определенных стадиях онтогенеза (гены глобулинов, альбумина, а-фетопротеина, иммуноглобулинов, мышечных белков, секреторных белков эндокринных и пищеварительных желез и многие другие).
Третью группу составляют гены, которые кодируют различные белки, участвующие в регуляции транскрипции (транскрипционные факторы). Белковые продукты этих генов взаимодействуют с регуляторными участками генов, вызывая усиление или подавление экспрессии.
К четвертой группе относят гены, экспрессия которых индуцируется внешними факторами, в том числе ксенобиотиками.
Одной из основных задач фармакогеномики является изучение экспрессии генов при различных заболеваниях и воздействии того или иного лекарства или биологически активного соединения. Это позволит определять возможность их направленной регуляции.
Успешное внедрение фармакогеномики в экспериментальную фармакологию стало возможным благодаря развитию соответствующих технологий в том числе и информационных (биоинформатика). Все они ассимилировали и интегрировали фармакогенетику в широкое научное направление.
В целом, все методы ДГЭ состоят из множества, часто повторяющихся одних и тех же операций. Выполнение их вручную малоинтересное занятие. Однако угрозой не является монотонная работа оператора, а значительно большей проблемой считается бесконечное повторение одних и тех же операций, что может привести к потере точности. Поэтому перед фармакогеномическими технологиями стоит одна задача - частичная или полная автоматизация аналитических операций.
Основой любой технологии является метод, имеющий в аналитической практике свои характеристики (параметры). Для ДГЭ они должны соответствовать следующим требованиям:
Разрешающая способность, связана с определенной точностью определения соседних генов;
Чувствительность - граница «-последовательностей разведения, дающих возможность статистически достоверно регистрировать изменения ДГЭ;
Охват - процент экспрессированных генов данного вида экспериментальных животных или определенной ткани, которые могут быть надежно определены и экспериментально повторяться;
Фальшпозитивная норма - количество генов, ошибочно отнесенных к экспрессированным;
Фальшнегативная норма - количество экспрессированных генов, однако отнесенных к неактивным.
Технологии ДГЭ включают две группы методов. Одна из них, так называемая закрытая, а вторая - открытая архитектурная система .
Закрытая архитектурная система требует информацию о каждом гене или клоне и использует в качестве анализатора микрочипы.
Теория создания микрочипов основана на гибридизации олигонуклеотидов известной последовательности, иммобилизованных на твердой поверхности в строго определенных местах, с меченой различными способами пробой. Способствовали созданию данной технологии последние достижения в информатике, химии полупроводников, микроэлектронной промышленности, а также обилие информации, которая накопилась за годы работы над программой «Геном человека».
ДНК-чип - миниатюрная пластина с микроячейками. Каждая микроячейка содержит искусственно синтезированные олигонуклеотиды, соответствующие фрагментам определенных генов, выступающих в качестве матрицы. В этих ячейках происходит комплементарное взаимодействие матрицы и пробы (кДНК исследуемых образцов). В настоящее время существует два направления в создании ДНК-чипов. Они различаются способом синтеза и нанесения матричных олигонуклеотидов .
Первое направление основано на предварительном синтезе олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды синтезируют химически или с помощью ПЦР (длина от 500 до 5000 оснований) и затем наносят на обработанную специальным образом стеклянную поверхность с помощью роботов. Такие типы чипов получили название кДНК-микрочипов (cDNA-microarray). В ПЦР ампли- фицируются последовательности кДНК определенных генов. Поэтому данный тип чипов дорогостоящий, так как необходимо создавать собственную кДНК-библиотеку или приобретать ее у крупных исследовательских центров.
кДНК-Микрочипы оказались непригодными для проведения исследований полиморфизма (генетическая изменчивость отдельного локуса в определенной популяции), мутационного анализа, сравнительного изучения экспрессии большого количества генов, так как плотность размещения матричных олигонуклеотидов очень ограничена (число ячеек составляет = 1000 на чип). Кроме того, применение длинных фрагментов ДНК (кДНК) снижает специфичность гибридизации с исследуемой пробой и появляются ложноположительные сигналы, не соответствующие реальной экспрессии генов.
Несмотря на перечисленные недостатки, основное преимущество кДНК-микрочипов - возможность варьирования качественным и количественным составом фрагментов генов.
Более перспективное направление создания чипов - применение фотолитографических технологий , которые дают возможность одновременно интегрировать огромное количество олигонуклеотидов любой последовательности непосредственно на поверхности чипа. Плотность размещения синтезированных таким образом нуклеотидов может достигать 1 млн. на 1 см2. Такие чипы, получившие названия ДНК-чипов (DNA-chips), производятся фирмой Affymetrix Inc. Матрица ДНК-чипа - короткая (20-25-мерная) олигонуклеотидная последовательность, причем каждому гену соответствует 15-20 таких олигонуклеотидов, что значительно повышает точность и воспроизводимость результатов. ДНК-чипы позволяют одновременно оценивать экспрессию практически неограниченного количества генов, производить исследование полиморфизма, в том числе и однонуклеотидных замен (SNP). В этом случае синтезируются олигонуклеотиды, специфические для каждой последовательности конкретного гена, учитывая все возможные варианты взаимного расположения нуклеотидов.
При проведении исследований чип гибридизуется с меченой различными способами пробой. При сравнительных исследованиях пробой, как правило, служит кДНК, полученная из контрольного и сравниваемого образцов. В качестве метки используются как радиоактивно меченые молекулы, так и флуоресцентные красители, непосредственно присоединенные к исследуемым образцам. При проведении сравнительного анализа обычно применяют двухцветную детекцию, при которой контрольная и опытная кДНК метятся разными красителями. Результаты регистрируют по интенсивности гибридизационных сигналов тех ячеек чипа, где произошла гибридизация, с последующей компьютерной обработкой данных.
Производятся и упрощенные варианты чипов с небольшим набором генов (в пределах 1000-2000). На нейлоновой мембране фиксируются короткие последовательности известных генов. Они гибридизуются с радиоактивно меченой пробой. Гибридизация детектируется методом радиоавтографии.
Следует отметить, что работа с чипами требует специального дорогостоящего оборудования для проведения гибридизации. Ожидается, что в ближайшие годы цены на комплекты оборудования для производства чипов и работы с ними будут снижены в связи с насыщением рынка.
Разработка и внедрение в науку и практику новых технологий часто является движущим моментом в развитии медикобиологических отраслей знаний как, например, это было с разработкой в недавнем прошлом технологии ПЦР. Развитие молекулярной биологии в настоящее время многим обязано ПЦР, а теперь и микрочипам. Внедрение технологии микрочипов принципиально и для фармакологии. Разработка новых лекарственных средств уже сейчас начинает основываться на информации о функциональной роли определенных генов в развитии патологии. Поэтому сроки разработок могут сократиться с 10-15 до 5-8 лет автора Хармар Хиллери
Роль племенного кобеля в процессе спаривания Как только кобель будет достаточно стимулирован сукой и захочет ее повязать, он взбирается на нее и крепко охватывает ее передними ногами, кончик полового члена выходит из препуция и после серии сильных попыток приникает в
Из книги Служебная собака [Руководство по подготовке специалистов служебного собаководства] автора Крушинский Леонид Викторович5. Теория стадийного развития и особенности развития животных В основе управления развитием организмов лежит теория стадийного развития, которую сформулировал академик Т. Д. Лысенко, исходя из работы И. В. Мичурина и многочисленных собственных исследований.Несмотря на
Из книги Биология [Полный справочник для подготовки к ЕГЭ] автора Лернер Георгий Исаакович Из книги Основы психофизиологии автора Александров ЮрийДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ СЕНСОРНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ Дифференциальная сенсорная чувствительность основана на способности сенсорной системы к различению сигналов. Важная характеристика каждой сенсорной системы – способность замечать различия в свойствах одновременно или
Из книги Эмбрионы, гены и эволюция автора Рэфф Рудольф А2.12. Дифференциальная чувствительность зрения Если на освещённую поверхность с яркостью I падает добавочное освещение dI, то, согласно закону Вебера, человек заметит разницу в освещённости только если dI/I = К, где К – константа, равная 0,01–0,015. Величину dI/I называют
Из книги Аквариум в школе автора Махлин Марк ДавидовичГлава 17 ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ПСИХОФИЗИОЛОГИЯ
Из книги Проблемы лечебного голодания. Клинико-экспериментальные исследования [все четыре части!] автора Анохин Петр КузьмичГибель клеток в процессе нормального развития Дегенерация вольфовых протоков в процессе развития особей женского пола и мюллеровых каналов у особей мужского пола - примеры наличия структур, которые вначале развиваются, а затем подвергаются некрозу. Эти процессы,
Из книги автораГены, вступающие в действие на более поздних стадиях развития и в процессе роста Ясно, что мутации генов, непосредственно определяющих морфогенетические пути, в особенности тех генов, которые действуют на ранних стадиях, могут вызывать чрезвычайно резкие изменения
Из книги автораГлава 10 Адаптации экспрессии генов в процессе развития Жизнь -это сила, которая проделывает бесчисленное множество экспериментов, пытаясь организовать себя... мамонт и человек, мышь и мегатерий, мухи и отцы церкви - все это результаты более или менее успешных попыток
Из книги автораСколько генов необходимо для развития? К счастью, существуют методы, позволяющие оценить количество генетической информации, имеющейся у высших организмов. Один из самых тонких таких методов - классическая менделевская генетика. Главная трудность, связанная с этим
Из книги автораЗНАЧЕНИЕ АКВАРИУМА В УЧЕБНОМ ПРОЦЕССЕ Аквариумы всегда привлекают детей разного возраста, вызывают их удивление, возбуждают любознательность. Но в условиях школы, когда ставится задача использовать аквариум на уроках ботаники, зоологии, общей; биологии, его
Из книги автораСостояние больных в процессе лечения На основании клинических наблюдений и лабораторных исследований в динамике клинического состояния больных в процессе лечения можно было отметить 6 стадий, из которых 3 относятся к разгрузочному периоду и 3 - к восстановительному.Эти